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技術(shù)文章

化學(xué)發(fā)光 | IVD行業(yè)技術(shù)擔當(下)

更新時間:2022-04-13 瀏覽次數(shù):3175

上一期,我們大致介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理和優(yōu)缺點,下面我們就來詳細說說三種分類的不同之處。
 

 

01

 

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是用化學(xué)發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的發(fā)光標記物。其通過起動發(fā)光試劑(NaOH?、H?O?)作用而發(fā)光,強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成, 為快速的閃爍發(fā)光。
 
吖啶酯作為標記物用于免疫分析,其化學(xué)反應(yīng)簡單、快速、無須催化劑;檢測小分子抗原采用競爭法,大分子抗原則采用夾心法,非特異性結(jié)合少,本底低;與大分子的結(jié)合不會減小所產(chǎn)生的光量, 從而增加靈敏度。
 
CLIA開發(fā)主要包括以下幾個步驟:
 

磁珠包被抗體

( 以下步驟需依據(jù)項目不同進行工藝優(yōu)化 )

BeaverBeads®Streptavidin鏈酶親和素磁珠

利用鏈酶親和素和生物素的高特異性結(jié)合能力,BeaverBeadsRStreptavidin可與biotin標記的高純度抗體/多肽分子或核酸分子特異性結(jié)合,并具有級聯(lián)放大的作用,是一種通用的具有標記和捕獲性能的固相介質(zhì)原料。

 

根據(jù)粒徑的不同,產(chǎn)品可用免疫檢測、探針捕獲、細胞分選等領(lǐng)域,尤其適用于化學(xué)發(fā)光免疫診斷。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下:

圖片
 
BeaverBeads®NHS生物配體快速偶聯(lián)磁珠

表面為NHS基團修飾的磁珠,能夠與帶有伯胺基團的蛋白和其他分子形成穩(wěn)定的肽鍵,用于親和純化或者分析檢測抗體、抗原和其他生物分子。

 

與傳統(tǒng)的羧基、氨基磁珠相比,無需事先采用EDC/NHS或戊二醛進行活化,只需簡單講含伯氨基的生物配體溶解于偶聯(lián)緩沖液中,室溫下將蛋白溶液與NHS磁珠混合即可將生物配體共價偶聯(lián)到磁珠上,偶聯(lián)效率可達90%以上;偶聯(lián)體系pH為5-9. 相關(guān)海貍產(chǎn)品如下:

圖片
 
BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠

具有快速磁響應(yīng)性超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異性吸附和豐富的結(jié)合位點等特點。在特定試劑(如EDC/NHS)作用下,將多種生物配體(蛋白、多肽、寡聚核苷酸、藥物分子等)共價偶聯(lián)到磁珠表面。常用于檢測、捕獲等試驗。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下:

圖片

 
Beaver Magnetic Seprator stand磁性分離器

為快速分離磁珠的手工操作或高通量的自動化操作而設(shè)計的一系列不同規(guī)格的專用磁性分離工具,適用于抗體純化、免疫沉淀、免疫共沉淀、細胞分選、核酸分離等相關(guān)實驗。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下:

圖片
 

吖啶酯標記抗體

①將0.5mg抗體用標記緩沖液(0.1M pH7.4 PB)預(yù)處理;
②將0.1mg的吖啶鹽加入到預(yù)處理的抗體中,放置于恒溫搖床中避光孵育過夜;
③標記完成后,將結(jié)合物純化,加入BSA等蛋白保護劑,4℃避光保存。
 
吖啶酯是一類可用作化學(xué)發(fā)光標記物的化學(xué)物質(zhì),吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物在有H?O?的稀堿性溶液中即能發(fā)光,不需要催化劑,發(fā)光系統(tǒng)簡單。
 
同時這類化合物的發(fā)光為閃光型,加入發(fā)光啟動試劑后0.4s左右發(fā)射光強度即達到最大,半衰期為0.9s左右,非常省時。
 
基于上述特點,為增強吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物的化學(xué)發(fā)光強度,有些在發(fā)光啟動試劑中加入triton x-100、tween-20等表面活性劑。相關(guān)產(chǎn)品如下:
圖片
 

上機檢測實驗

①將磁珠包被物和吖啶酯標記物分別稀釋至工作濃度,配成試劑;
②設(shè)置全自動化學(xué)發(fā)光儀,裝載試劑,標準品質(zhì)控品樣本分別上機,選擇對應(yīng)的項目,直接進行檢測;
③檢測剩余時間及檢測結(jié)果會顯示在屏幕上,可通過“查詢”查看歷史數(shù)據(jù),點擊“導(dǎo)出”可將數(shù)據(jù)保存為Excel格式文件。
 

02

 

間接化學(xué)發(fā)光免疫分析

間接化學(xué)發(fā)光免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光酶免疫分析,以酶標記生物活性物質(zhì)進行免疫反應(yīng),免疫復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測試。常用的標記為HRP和AP,它們的底物分別為魯米諾AMPPD。
 
1
具體工藝流程:
 
 

包被抗體的磁性微粒

 

加入樣本、標準品

 

清洗

 

加入酶標抗體/生物素化抗體

 

洗板

 

加入鏈酶親和素HRP

 

清洗

 

加入底物液

 

測試發(fā)光信號(如是板式發(fā)光可參考Elisa操作方式

 

化學(xué)發(fā)光 (ECL)底物相關(guān)產(chǎn)品:
圖片

 

03

 

電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)是電化學(xué)發(fā)光和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物,是標記免疫測定技術(shù)之一。
 
在電極表面有電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng),用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 標記 Ab,通過 Ag-Ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù),根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的 Ag或 Ab 進行定量 / 定性。
 
ELIA 具有高度敏感,可達 Pg/ml 或 pmol ;特異性強,可重復(fù)性好,CV<5%;測定范圍寬;試劑穩(wěn)定,無毒害,無污染,有效期長。操作簡單,易于自動化。
 
三聯(lián)吡啶釕:
圖片
 
三丙胺(TPA):
圖片
 

如您需咨詢海貍磁珠等問題可聯(lián)系東銳科技為您排憂解難。

 

 

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